CAR-T療法正在改變腫瘤治療的前景，但其生產本身也面臨一系列挑戰。與大多數藥物不同，由于CAR-T療法使用患者自己的T細胞，是高度個性化的，細胞治療產品的質量在批次和患者之間存在顯著差異。在開發過程中，最重大的挑戰之一是表征制備CAR-T產品的質量和效力。IsoPlexis單細胞蛋白組學技術幫助研究者很好的迎接這方面的挑戰。

IsoPlexis技術評價單細胞的多功能性，根據其功能定義細胞的質量

IsoPlexis系統檢測每個單個細胞分泌的特定細胞因子，并識別多功能細胞和細胞亞群（那些細胞分泌兩個或更多細胞因子），這些亞群在多種研究和疾病治療相關。IsoPlexis平臺還可以在表型相同的樣本中檢測到細胞功能異質性，這些細胞及其異質性帶來的特質會被流式技術或群組檢測的技術忽略（圖1）。IsoLight全自動單細胞蛋白質組學分析系統對細胞功能深度分析，文獻數據顯示與患者臨床結果關聯，未來可成為細胞治療產品的療效預判與監控。

圖1. 表型相同的細胞，表現出功能的異質性

應用案例

在這里，我們討論了一個研究案例，研究人員使用了Miltenyi自動化系統進行上游的靶向CD19/CD22雙特異性CAR-T制備，接著使用IsoLight單細胞分析平臺進行下游的細胞功能質量評估。研究人員采用了兩種生產制備方法，對比了不同的方法制備的CAR-T細胞的差異（圖2）。第一種方法（M1）在第5天以洗滌步驟終止轉染，而第二種方法（M2）在第3天終止轉染。

復蘇的CAR-T細胞用抗CD4或抗CD8磁珠分選，并與表達CD19或CD22抗原的靶細胞共培養。去除靶細胞后，將CAR-T細胞懸液載入IsoCode單細胞蛋白質組芯片，捕獲單細胞的細胞因子信號，數據使用IsoSpeak軟件進行分析。結果表明，無論是靶向CD19還是CD22的CAR-T細胞，使用M2方法制備得到的細胞，細胞多功能指數更高(圖3上)；CD4+（左）和CD8+（右）CAR-T產品中，使用M2方法制備的細胞，多功能細胞的占比更高(圖3下)。即使用M2制備的CAR-T產品表現出更高的多功能性，也表現在效應性因子和刺激性細胞因子的增加。這一單細胞多功能數據清楚地表明，與之前使用的M1相比，M2顯著改善了雙特異性CD19/CD22 CAR-T細胞產品的功能。

圖3. PSI和細胞多功能性是評價細胞功能的標尺

精確的功能質量分析在CAR-T制備的重要性

在評價CAR-T產品評價過程中，細胞數量和活力的增加并不總是與細胞功能的增強跟最終治療效果正相關。上述研究使用IsoSpeak多維生信分析軟件，細胞多功能指數(Polyfunctional Strength Index PSI)對這兩種方法進行了評價。PSI同時涵蓋了細胞因子分泌的廣度(多功能，即分泌兩個或更多細胞因子的單個CAR-T細胞)和細胞因子分泌的強度（分泌量）。PSI可以作為獨特的標尺在治療應用之前評估細胞產品的效力。早在2018年一篇Blood文章中研究了治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)靶向CD19 CAR-T細胞，檢測了在輸注前CAR-T細胞的多功能性及PSI指數，并發現與臨床結果有正相關性。研究表明，這些患者輸注前CAR-T的多功能性與患者接受治療后的客觀反應(OR)和細胞因子釋放綜合征(CRS)具有統計學正相關性，通過單細胞體外實驗能夠預測臨床治療結果及不良反應。PSI可以有效區分對治療有應答者和無應答者。

自動化端到端(End-to-end)工作流程的數據穩定性

考慮到細胞治療產品生成跟品質，細胞治療行業從細胞處理工作流程，細胞分離、細胞培養到最終細胞產物的配方都需要更多自動化的流程。IsoPlexis的IsoLight單細胞因子檢測系統采用全自動檢測的工作方式，包含細胞培養，捕獲因子信號，多重因子檢測，影像數據讀取及導出。簡單直觀的IsoSpeak多維生信分析軟件，無需特別培訓生信分析人員來進行數據分析。大幅提高工程細胞產品開發和流程的優化。

參考文獻：